Biološki označevalci akutne oblike bolezni presadka proti gostitelju

UVOD

Eden izmed možnih načinov zdravljenja hematoloških (malignih) bolezni je alogenska presaditev krvotvornih matičnih celic (aloPKMC), ki predstavlja možnost ozdravitve bolnikov z najbolj neugodno prognozo. Pri omenjenem načinu zdravljenja bolnika ogrožajo predvsem okužbe in bolezen presadka proti gostitelju (GVHD, angl. Graft versus Host Disease), ki predstavlja glavni razlog umrljivosti bolnikov po aloPKMC (1, 2).

GVHD je sistemska bolezen. Do akutnega GVHD (aGVHD) praviloma pride v prvih 100 dneh po aloPKMC, pojavi se pri približno 40 % bolnikov s sorodnim darovalcem krvotvornih matičnih celic (KMC) in pri 50–60 % bolnikov, ki so prejeli KMC nesorodnega darovalca (3). Kronična oblika GVHD (cGVHD) se praviloma pojavi več kot 100 dni po PKMC ter tudi pomembno vpliva na umrljivost in kakovost življenja bolnikov po presaditvi. Nastane zaradi tkivne poškodbe timusa, kar vodi v motnje v toleranci limfocitov B in T in pripelje v nastanek aloreaktivnih protiteles ter posledično v nastanek kroničnega vnetja in tkivne fibroze (3).

Pri aGVHD v prvi stopnji pride do poškodbe gostiteljevega tkiva, ki jo povzročita kemoterapija in/ali obsevanje v sklopu kondicioniranja. To povzroči izpostavitev z nevarnostjo in z mikrobi povezanih molekulskih vzorcev (DAMP, angl. Danger-Associated Molecular Pattern in PAMP, angl. Pathogen-Associated Molecular Pattern), kar aktivira prejemnikove (in/ali darovalčeve) antigen predstavitvene celice (APC) in posledično pride do sproščanja vnetnih citokinov (npr. tumor nekrotizirajoči faktor alfa (TNF-α), interlevkin-6 (IL-6), IL-1). Poleg tega kondicioniranje in uporaba profilaktičnega antibiotičnega zdravljenja povzročita tudi izgubo raznovrstnosti črevesne mikrobiote. Bakterijski produkti, ki prehajajo preko poškodovane črevesne sluznice, še dodatno spodbudijo aktivacijo APC. V drugi stopnji APC darovalčevim limfocitom T predstavijo antigene prejemnika, kar povzroči aktivacijo in ekspanzijo celic T pomagalk in zaviralk. Le-ti nato potujejo v tarčne organe in v zadnji stopnji povzročijo poškodbo tkiva, pri čemer pride tudi do okrepljenega sproščanja različnih vnetnih in citotoksičnih dejavnikov, kar še okrepi imunski odziv proti prejemniku in vodi v apoptozo in nekrozo prejemnikovih celic ter tako poveča poškodbo tkiva (3).

Bolezen se lahko izrazi v različnih oblikah – od blage, ki ne potrebuje zdravljenja, do hude, ki ogroža življenje in se pojavi v 10–15 %. Najpogosteje so prizadeti koža, jetra in prebavila, poznamo pa tudi atipično obliko aGVHD, ki prizadene žleze, kostni mozeg in centralni živčni sistem (1, 4). Diagnostika aGVHD trenutno temelji predvsem na dokaj nespecifičnih kliničnih znakih bolezni in histološki analizi prizadetega tkiva, zato bi bili označevalci, ki bi jih lahko določali iz vzorcev, odvzetih na čim manj invaziven način, zelo dobrodošli. Njihova potencialna vloga pa ni vezana le na postavitev diagnoze, prognoze ali napoved poteka aGVHD, ampak tudi na spremljanje učinkovitosti zdravljenja tega zapleta (5). Hkrati pa njihovo odkrivanje pripomore tudi k razumevanju patofiziologije bolezni in iskanju novih tarč pri načrtovanju zdravljenja (3).

Preživetje bolnikov je sorazmerno klinični resnosti bolezni, vendar šele takrat, ko so simptomi najbolj izraženi, česar pa ne moremo oceniti na začetku, ob pojavu prvih simptomov bolezni. Pri bolnikih, pri katerih pride do odpornosti na zdravljenje s steroidi (SR-GVHD, angl. Steroid-Refractory GVHD), ki se uporabljajo kot prva linija zdravljenja, je smrtnost visoka (70–90 %). Ob poznavanju ustreznih označevalcev bi le-ti pomagali pri zgodnji izbiri ustreznega zdravljenja. Pretirano zdravljenje namreč lahko povzroči preveliko imunosupresijo, kar poveča verjetnost nastanka okužb, hkrati pa se zaradi zmanjšanja učinka presadka proti levkemiji (GVL, angl. Graft versus Leukemia) poveča možnost ponovitve bolezni. Po drugi strani se pogosto izkaže, da je potrebno močnejše zdravljenje, šele ko prvo zdravljenje ni zadostno (6). Na steroide neodzivna je pogosto črevesna oblika GVHD (GI-GVHD). Ta se kaže z znaki, kot so bolečine v trebuhu, slabost, bruhanje in (krvava) driska. Taki simptomi se lahko pojavijo tudi pri drugih zapletih po aloPKMC, kot so okužbe gastrointestinalnega trakta, kolitis kot posledica zdravljenja ali s transplantacijo povezana trombotična mikroangiopatija (TA-TMA, angl. Transplantat-Associated Thrombotic Microangiopathy), za katero je prav tako značilno slabo preživetje (7). TA-TMA označuje endotelijska disfunkcija in aktivacija komplementa, kar vodi v nastanek mikrotrombov in posledično v trombocitopenijo, mikroangiopatično hemolitično anemijo in prizadetosti različnih organov. Največkrat so prizadeta ledvica, gastrointestinalni trakt, centralni živčni sistem in pljuča, lahko pride tudi do odpovedi večorganskih sistemov (8).

Čeprav je aGVHD povezan z epitelijsko poškodbo, pa vedno več dokazov kaže na povezanost med SR-GVHD in poškodbo endotelija (9). K aktivaciji in poškodbi endotelija pri aloPKMC prispevajo različni dejavniki, kot so obsevanje in kemoterapija v sklopu kondicioniranja, različni vnetni dejavniki, ki se sproščajo iz tkiva ob njegovi poškodbi, endotoksini, ki prehajajo skozi poškodovano črevesno sluznico, in profilaktično imunosupresivno zdravljenje za preprečevanje aGVHD. Poškodbo endotelija povzročajo tudi aloreaktivni limfociti T, ki prepoznajo neujemajoče se humane levkocitne antigene (HLA) na površini endotelijskih celic. Prav podaljšana aktivacija in poškodba endotelija imata pomembno vlogo tudi pri pojavu nekaterih drugih zapletov po PKMC, kot je npr. TA-TMA (10).Teorija, ki TA-TMA opisuje kot tristopenjski proces (angl. Three-Hit-Hypothesis), predpostavlja, da je v njen nastanek vpletena endotelijska aktivacija, ki povzroči izgubo zaščitnih mehanizmov endotelija, kar skupaj z dodatnimi dejavniki, kot so npr. okužbe, aloreaktivni limfociti T in profilaktično zdravljenje, vodi v poškodbo endotelija, aktivacijo komplementa, nastanek mikrotrombov in posledične tkivne ishemije. Hkrati so ugotovili, da je pomemben dejavnik pri razvoju TA-TMA tudi genetska predispozicija za aktivacijo komplementa in endotelijsko poškodbo, kar v omenjeni teoriji predstavlja prvi zadetek (7, 8).

V prispevku so predstavljeni biološki označevalci aGVHD s poudarkom na tistih, ki bi lahko služili pri zgodnji prepoznavi bolnikov s težko obliko aGVHD. To so namreč bolniki, pri katerih je potrebno čimprejšnje intenziviranje imunosupresije za preprečitev poslabšanja aGVHD in zmanjšanje verjetnosti za nastanek nekaterih drugih zapletov, kot je tudi TA-TMA. Glede na prekrivanje entitet med (SR)-GVHD in TA-TMA smo v pregled vključili označevalce, povezane z obema zapletoma. Povzetek glavnih skupin označevalcev in njihove vloge je prikazan tudi v Tabeli 1.

SERUMSKI IN PLAZEMSKI OZNAČEVALCI

Nobeden izmed številnih v literaturi opisanih označevalcev ni popolnoma specifičen za aGVHD oziroma TA-TMA. Najbolj proučevani so topni serumski oziroma plazemski označevalci, ki se sproščajo iz poškodovanega tkiva in (imunskih) celic, vključenih v patofiziologijo omenjenih stanj (3). Označevalce aGVHD lahko razdelimo na splošne (npr. različni citokini in receptorji zanje) in organsko specifične (npr. hepatocitni rastni dejavnik za jetrno obliko, elafin za kožno obliko). Označevalec, specifičen za GI-GVHD, ki je povezana z največjo smrtnostjo, je REG3α (angl. regeneration islet-derived protein 3α), ki se v kri sprosti iz poškodovanih Panethovih celic, ki se nahajajo v črevesnih kriptah. REG3α je lektin, pomemben pri zaščiti črevesne sluznice, saj pokriva luminalno stran enterocitov in tako predstavlja “pregrado” med enterociti in črevesno mikrobioto. Količina REG3α v krvi je sorazmerna s količino poškodovanih Panethovih celic. Tako ta preiskava služi kot “tekočinska biopsija” tankega črevesa, ki lahko pokaže poškodbo črevesja še pred pojavom simptomov GI-GVHD (7 dni po PKMC). Količina REG3α narašča z resnostjo GI-GVHD, poleg tega je koncentracija tega proteina pri tistih, ki imajo GI-GVHD, trikrat višja kot pri bolnikih z enteritisom oz. pri tistih, ki GI-GVHD nimajo (11, 12, 13).Višje vrednosti REG3α tik pred aloPKMC in po začetku zdravljenja so bile dokazane pri bolnikih, ki niso odgovorili na zdravljenje z ruksolitinibom – zaviralcem Janus kinaze 2 (JAK2), za katerega je bila dokazana učinkovitost pri zdravljenju SR-GVHD (14, 15).

Iz poškodovanih celic prizadetega tkiva se sprošča tudi alarmin IL-33, kar v tarčnih celicah vodi do večjega proizvajanja vnetnih dejavnikov. IL-33 se veže na membransko vezani receptor ST2 (angl. suppressor of tumorigenicity 2), katerega izražanje se poveča na aktiviranih limfocitih T. Topni ST2 (sST2) tudi veže IL-33 in s tem prepreči njegovo vnetno delovanje (11). Ob aGVHD se izločanje sST2 iz poškodovanih (predvsem endotelijskih) celic poveča. Prepoznan je bil tudi kot plazemski označevalec, ki kaže na SR-GVHD. Visoka koncentracija sST2 pred PKMC je povezana tudi z večjim tveganjem za nastanek TA-TMA (16).

Tako sST2 kot tudi REG3α sicer neodvisno napovedujeta umrljivost bolnikov z aGVHD, vključena pa sta tudi v algoritem MAGIC (Mount Sinai Acute GVHD International Consortium), ki ima prognostični pomen in napoveduje dolgoročne izide zdravljenja pred (7. dan po PKMC), ob ali po pojavu simptomov in začetku zdravljenja aGVHD bolje, kot če le-te napovemo samo na podlagi kliničnih simptomov (11, 12, 17).

Plazemski koncentraciji sST2 in REG3α sta skupaj z receptorjem tumor nekrotizirajočega faktorja 1 (TNFR1), ki je nadomestni označevalec TNF-α, ki ga proizvajajo limfociti T in povečuje poškodbo tkiva, vključena v algoritem Ann Arrbor. Ta algoritem na podlagi določitve koncentracije omenjenih označevalcev ob pojavu aGVHD napove verjetnost odziva na terapijo s steroidi, razvoja GI-GVHD in umrljivost, ki ni povezana s ponovitvijo bolezni (NRM, angl. non relapse mortality) v 6 mesecih neodvisno od ostalih kliničnih dejavnikov tveganja (npr. neujemanje HLA, starost, vrsta kondicioniranja ...) in bi bil potencialno lahko uporabljen kot pomoč pri izbiri ustreznega zdravljenja (6).

Iskanje novih potencialnih označevalcev GVHD so v zadnjem času olajšala različna informacijska orodja in razvoj masne spektrometrije, s katero so dokazali spektralne vzorce značilne za aGVHD, vendar ta tehnika ne omogoča prepoznave posameznih proteinov. Poleg tega je delovno zahtevna in dolgotrajna, vendar pri njej nismo omejeni z dostopnostjo protiteles. Hkratno določitev različnih označevalcev omogočajo tudi proteinske mikromreže, pri katerih problem predstavljata predvsem visok signal ozadja in nespecifična vezava, kar lahko izboljšamo z uporabo drugih imunokemijskih metod za kvantifikacijo posameznega proteina. Najpogosteje se uporablja sendvič encimsko imunska metoda na trdi podlagi (ELISA, angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Vendar na rezultat lahko vplivajo uporabljena protitelesa in kalibratorji, kar lahko vodi do razlik med rezultati testov različnih proizvajalcev (3, 18, 19).

CIRKULIRAJOČE ENDOTELIJSKE CELICE

Obetaven označevalec endotelijske poškodbe predstavljajo cirkulirajoče endotelijske celice (CEC), to so namreč zrele celice, ki se ob žilni poškodbi izplavijo v kri (20). Povišano število omenjenih celic je bilo dokazano pri mnogih stanjih, povezanih z žilno poškodbo, npr. miokardni infarkt in sladkorna bolezen (21, 22). V primerjavi z zdravimi osebami je bila povišana koncentracija CEC dokazana tudi pri bolnikih s (hematološkimi) malignimi boleznimi (23).

Kondicioniranje pred aloPKMC oziroma njegova vrsta (mieloablativno/nemieloablativno) prispeva k endotelijski poškodbi, kar posledično vodi v višje število CEC (24). Pri interpretaciji rezultatov pa moramo upoštevati še možen vpliv drugih dejavnikov, ki povzročijo poškodbo endotelija, kot so npr. okužbe, zdravila (3). Koncentracija CEC ob vgnezditvi (angl. engraftment) je nižja pri tistih, pri katerih se kasneje razvije aGVHD, v primerjavi s tistimi, pri katerih do aGVHD ne pride (25). Poleg tega je bil dokazan statistično značilen porast CEC ob pojavu simptomov aGVHD (26). V drugi študiji so pri bolnikih z aGVHD ugotovil nižje število CEC kot pri tistih, ki aGVHD niso razvili, vendar so CEC določali ob vnaprej določenih časovnih točkah in torej ne nujno ob pojavu simptomov aGVHD (24). Zaradi hitrega spreminjanja števila CEC bi njihovo določanje ob pojavu simptomov aGVHD lahko služilo kot pomoč pri razlikovanju aGVHD od drugih zapletov, pri katerih endotelij ni vpleten (26).

Raziskav, ki bi ugotavljale povezavo med CEC in TA-TMA, je malo. V eni izmed študij je bilo sicer dokazano, da imajo bolniki z žilnimi zapleti po aloPKMC višje vrednosti CEC, pri čemer je glavna pomanjkljivost omenjene študije majhno število vključenih bolnikov (27).

Poleg CEC pa se v krvi nahajajo tudi endotelijske prekurzorske celice (EPC). To so celice, ki sodelujejo pri nastanku novih žil ter regeneraciji poškodbe obstoječih žil in tako kažejo na regeneracijsko sposobnost žilja (28). Vloga EPC pri aGVHD in TA-TMA za zdaj še ni popolnoma pojasnjena. Dokazano je bilo, da je pri bolnikih z aGVHD koncentracija EPC ob diagnozi bolezni narasla, medtem ko je pri tistih, ki aGVHD niso razvili, ostala nizka. Prav tako pa je pri tistih s SR-GVHD koncentracija EPC ostala visoka, medtem ko je pri bolnikih, ki so se na zdravljenje odzvali, padla na začetno vrednost (29). Hkrati histološki dokazi kažejo, da se ob aGVHD v koži in gastrointestinalnem traktu poveča vaskularizacija. Ena izmed možnih razlag teh rezultatov predvideva, da endotelijska poškodba vodi v višje število EPC, kar privede do povečane vaskularizacije in nazadnje pride do poškodbe endotelijskih celic s strani aloreaktivnih limfocitov, kar povzroči porast CEC (30). Nasprotno pa je bil v drugi študiji porast EPC v periferni krvi 14. dan po aloPKMC v skupini bolnikov z aGVHD omejen (25). Na živalskem modelu pa je bilo dokazano, da injiciranje EPC po aloPKMC ublaži aGVHD (31).

CEC in EPC so v krvi zelo redke. Posledično je potrebna analiza velikega števila celic, za njihovo določanje pa se lahko uporabljajo različne metode, ki sicer niso standardizirane. Pogosto uporabljena metoda za določanje CEC in EPC je pretočna citometrija, kjer prav tako različne raziskovalne skupine, poleg različnih načinov izolacije celic, za njihovo prepoznavo uporabljajo različne imunofenotipe (32). Nimamo namreč celičnega označevalca, ki bi bil popolnoma specifičen za omenjene celice, zato njihova prepoznava temelji na kombinaciji različnih označevalcev. Pogosto uporabljeni označevalci za prepoznavo CEC so CD31, CD34 in CD146, za prepoznavo EPC pa CD34, CD133 in CD309. Za izključitev nespecifičnih dogodkov je priporočljivo dodati še negativne označevalce, npr. CD45, in označevalce nukleinskih kislin ter označevalce živosti celic. Poleg tega pa je priporočljiva uporaba izotipske kontrole (28, 33). Prav uporaba različnih metod in imunofenotipov v različnih študijah je lahko vzrok za različne rezultate dosedanjih študij, ki so proučevale CEC kot možen označevalec aGVHD. Kljub razlikam CEC ostajajo obetaven označevalec za prepoznavo aGVHD, bi pa bilo potrebno pred uporabo metode v vsakdanji klinični praksi standardizirati protokole za prepoznavo in kvantifikacijo teh celic. Prednost uporabe pretočne citometrije pri prepoznavi CEC in EPC predstavlja dejstvo, da lahko omenjene celice določamo hkrati (33).

ZUNAJCELIČNI VEZIKLI

Zunajcelični vezikli (EV, angl. extracellular vesicle) so sferične membranske strukture, ki lahko kažejo na celično poškodbo oziroma aktivacijo, pomembni pa so tudi pri medcelični komunikaciji (34). Glede na njihovo velikost EV delimo na eksosome (30–100 nm), mikrovezikle (100–1000 nm) in apoptotska telesca (1000–5000 nm). Sestavljajo jih različne biološke molekule, njihova sestava pa je odvisna od tega, iz katere celice so nastali in od (pato)fizioloških procesov v teh celicah. Ker se nahajajo v mnogih bioloških vzorcih, imajo kot neinvazivni označevalci z diagnostično in prognostično vlogo velik potencial pri različnih boleznih (35), med drugim tudi pri aGVHD, kjer je bilo dokazano povišano število endotelijskih EV (EEV), kar kaže na prisotnost endotelijske poškodbe (36, 37). Poleg tega je bilo pri bolnikih z aGVHD dokazano povišano število eritrocitnih EV (Eri-EV), medtem ko pri bolnikih z okužbami do povišanja ni prišlo (38). Višja koncentracija celokupnega števila EV (TEV) in Eri-EV ob vgnezdenju je povezana z večjim tveganjem za razvoj aGVHD. Dokazan je bil tudi vpliv kondicioniranja na število EV, saj je bila koncentracija EV pri mieloablatinem kondicioniranju v primerjavi z nemieloablativnim višja, pri čemer je bila pri nemieloablativnem kondicioniranju povezava med Eri-EV in aGVHD še močnejša (34). Pri bolnikih, pri katerih je bila poleg aGVHD prisotna tudi mikroangiopatija, je bilo povišanje Eri-EV največje. Prav tako je bila pri tistih, ki so preživeli TA-TMA, opažena dolgotrajno povišana koncentracija Eri-EV, vendar je bilo število sodelujočih, pri katerih je prišlo do mikroangiopatije, majhno (38, 39).

Poleg določanja Eri-EV, EEV in TEV je bilo proučevano tudi izražanje posameznih antigenov na površini EV. Večje izražanje CD146 je povezano z večjim tveganjem, večje izražanje CD31 in CD140α pa z manjšim tveganjem za razvoj aGVHD. CD146 je sicer označevalec endotelijskih celic, ki ga najdemo tudi na subpopulaciji limfocitov T (Th17). Čeprav je delež teh limfocitov pri aGVHD povišan, pa je za omenjeno stanje značilna tudi endotelijska poškodba. Ker je intenziteta fluorescence CD146 sorazmerna z intenziteto fluorescence nekaterih drugih endotelijskih označevalcev, avtorji predpostavljajo, da CD146 pozitivni EV izvirajo prav iz endotelijskih celic. CD31 je prav tako membranski antigen, ki se ne nahaja le na endotelijskih celicah, ampak tudi na trombocitih in na nekaterih drugih celicah (npr. limfocitih T ter APC). Med drugim preprečuje povečano aktivacijo limfocitov T, saj zviša aktivacijski prag T celičnega receptorja. CD140α, znan tudi kot PDGFRα (angl. platelet-derived growth factor receptor-alpha), ima pomembno vlogo pri migraciji fibroblastov in celjenju ran oziroma obnovi poškodovanega tkiva (40).

Pomembno vlogo pri razvoju aGVHD imajo tudi limfociti T, ki se nahajajo v tarčnem organu. Antigena za prepoznavo teh tako imenovanih tkivnih spominskih limfocitov T (TRM, angl. tissue resident memory) sta CD69 in CD103, ki imata pomembno vlogo pri “zadrževanju” teh celic v tkivu, zato so omenjene celice v krvi zelo redke. Lahko pa v krvi določamo EV; njihova sestava je namreč odvisna od vrste in stanja celic, iz katerih izvirajo (41, 42). Ugotovljeno je bilo, da aktivirane endotelijske celice lahko spodbudijo izražanje CD69 na limfocitih (41). Visoka serumska koncentracija CD69 pozitivnih EV pred aloPKMC je povezana z večjim tveganjem za razvoj aGVHD, pri čemer CD69 pozitivni EV soizražajo CD45, kar kaže na levkocitni izvor (42).

Metode za določanje EV za zdaj še niso standardizirane, na rezultate analize pa lahko vplivajo mnogi dejavniki. Še posebej pomemben je način izolacije EV, ki se priporoča za zmanjšanje vpliva motečih snovi na analizo (34, 43). Prav tako so za analizo EV možne različne metode. Metoda, ki omogoča tako prepoznavo različnih EV kot tudi njihovo kvantifikacijo, je pretočna citometrija (44). Določanje EV otežujeta predvsem njihova majhnost in dejstvo, da imajo na svoji površini manjšo količino proteinov, torej je izražanje označevalcev na njihovi površini šibko, zato za njihovo analizo potrebujemo občutljive pretočne citometre, njihova prepoznava pa bolj kot na podlagi sipanja svetlobe temelji na uporabi fluorescenčnih označevalcev (45).

MIKRO RNA

Poleg membranskih struktur so za opravljanje (pato)fiziološke vloge EV zelo pomembne tudi snovi, ki se nahajajo znotraj EV. Med drugim se v notranjosti EV nahajajo tudi različne kodirajoče in nekodirajoče RNA. Pogosto proučevane so prav mikro RNA (miRNA), ki z vezavo na komplementarno informacijsko RNA (mRNA) preprečijo njeno izražanje. Proučevanje različnih miRNA, ki se nahajajo znotraj EV ali pa prosto v krvi, je predmet različnih študij, povezanih z aGVHD, tako v smislu iskanja označevalcev te bolezni kot tudi ugotavljanja patofizioloških mehanizmov bolezni (46).

Lia s sodelavci je dokazal, da kombinacija izražanja CD146 na EV, plazemska koncentracija sTNFR1 in izražanje miR-100 ter miR-194 v EV najbolje ločuje med bolniki z in brez aGVHD ob pojavu bolezni. miR-100 ima pomembno vlogo pri uravnavanju neovaskularizacije pri aGVHD in postopno narašča od PKMC do pojava aGVHD. Pri tistih, ki so kasneje razvili aGVHD, sta bili pred kliničnim pojavom bolezni v EV povišani tudi količina miR-194 in miR-155; slednja ima pomembno vlogo pri uravnavanju T celičnega odziva (43). Za serumsko vrednost miR-155 je bilo dokazano, da je sorazmerna s težo aGVHD (47).

Pogosto proučevana miRNA v povezavi z aGVHD je miR-146a, ki je pomembna pri uravnavanju izražanja TNF-α, zmanjšano izražanje te miRNA pa je povezano z resnostjo aGVHD (48). S slabšim preživetjem in z resnostjo bolezni je povezano tudi povišanje miR-181a v serumu ob pojavu simptomov aGVHD, medtem ko zmanjševanje miR-181a kaže na odgovor na zdravljenje. Poleg tega je bila dokazana značilna razlika med ravnjo izražanja miR-181 pri bolnikih z aGVHD in tistih z akutno zavrnitvijo presajene ledvice, zdravih osebah in bolnikih s sepso, kar kaže na specifičnost tega označevalca (49).

V različnih študijah je bilo sicer dokazanih še veliko drugih miRNA, ki predstavljajo možno tarčo za zdravljenje ali pa imajo potencialno napovedno, diagnostično ali prognostično vrednost za aGVHD in so večinoma vpletene v regulacijo imunskega odziva (3).

Tako kot EV lahko tudi miRNA določamo v različnih bioloških vzorcih, odvzetih na neinvaziven način. Pogosto uporabljena metoda za njihovo določitev je kvantitativna verižna reakcija s polimerazo s predhodno reverzno transkripcijo (RT-qPCR). Njeni prednosti sta dobra občutljivost in specifičnost, poleg tega se omenjena metoda tudi sicer uporablja v diagnostiki in spremljanju hematoloških bolezni in je tako na voljo v vseh transplantacijskih centrih (50). Po drugi strani pa analizo miRNA omejuje predvsem dejstvo, da na rezultat lahko vplivajo različni predanalitični in analitični dejavniki, kot so izbor ustreznega matriksa, čas do analize, shranjevanje vzorca, način izolacije miRNA in izbor najustreznejšega načina za normalizacijo rezultatov. Zato je tudi pri analizi miRNA pred uvedbo v vsakdanjo klinično prakso potrebno overjanje metode za njihovo določanje (51).

ZAKLJUČEK

Glavni razlog umrljivosti bolnikov po aloPKMC predstavlja aGVHD. Smrtnost je največja pri bolnikih, ki se ne odzovejo na zdravljenje, do česar najpogosteje pride pri GI-GVHD. Z enakimi znaki kot GI-GVHD pa se kaže tudi TA-TMA, ki je prav tako povezana s slabim preživetjem. Zaradi pomanjkanja enotnih diagnostičnih kriterijev in prekrivajočih se entitet med (SR)-GVHD in TA-TMA v različnih študijah uporabljajo različne načine prepoznave omenjenih stanj, kar vodi v neenotno in prekrivajočo se opredelitev obeh zapletov. Pri postavitvi diagnoze nam sicer lahko pomaga histološka analiza prizadetega tkiva, pri čemer je biopsija invaziven postopek, ki je še posebej tvegan pri trombocitopeniji in zato pogosto neizvedljiv (52). Zato bi bili označevalci, ki bi jih lahko določali na neinvaziven način (npr. iz periferne krvi) in bi pomagali pri zgodnji prepoznavi (predvsem tistih bolnikov s težko obliko) aGVHD, zelo dobrodošli (3). Poleg iskanja označevalcev aGVHD pa je pomembno tudi iskanje označevalcev cGVHD. Tudi pri cGVHD so obetavni različni serumski in plazemski označevalci, miRNA, kot pomembni pa so se izkazali tudi nekateri celični označevalci, predvsem določanje različnih subpopulacij limfocitov (3).

Kljub številnim študijam bioloških označevalcev GVHD za zdaj še nobeden ni samostojno umeščen v smernice za klinično obravnavo bolnika. V posameznih transplantacijskih centrih se uporablja le določanje sST2 ter REG3α. Glavni razlog je, da metode za določanje označevalcev še niso standardizirane, hkrati pa lahko na njihovo koncentracijo vplivajo različni dejavniki (npr. vrsta kondicioniranja in uporaba profilaktičnega zdravljenja). To ob pomanjkanju enotnih diagnostičnih kriterijev in razlik med vključitvenimi kriteriji v različnih študijah omejuje njihovo uporabo v vsakdanji klinični praksi. Zato je poleg odkrivanja novih označevalcev v prihodnosti nujno tudi delo na standardizaciji laboratorijskih metod za njihovo določanje in klinični validaciji odkritih označevalcev oziroma njihovih kombinacij, pri čemer je nujno sodelovanje med zdravniki in laboratorijskimi strokovnjaki (5, 53).