Sprememba p.R577X gena ACTN3 (rs1815739) je povezana s pojavnostjo poškodb slovenskih nogometašic

UVOD

Genetsko testiranje omogoča opredelitev genetskih sprememb pri posamezniku, ki lahko vplivajo na razvoj bolezni ali na posameznikove lastnosti (1). V zadnjih 20 letih je bilo opravljenih precejšnje število raziskav, ki so preučevale vpliv genetske raznolikosti na področju vzdržljivosti v športu (2). Za genetsko testiranje na področju športa je veliko povpraševanje, saj je za starše in trenerje odločitev za usmeritev otrok v šport ali športno panogo, ki bi mu genetsko ustrezala, zelo privlačna (3).

Glavni izziv pri vprašanju, kako genetske spremembe vplivajo na športno vzdržljivost, je njihov vsestranski vpliv na delovanje organizma. Zaradi različnih sistemov (mišično-skeletni, kardiovaskularni, dihalni itd.), ki morajo v človeškem telesu delovati usklajeno, na vzdržljivost pri posameznem športu vplivajo številni dejavniki. Poleg različne telesne morfologije sta pri športnikih pomembna dejavnika vzdržljivosti predvsem aerobna vzdržljivost, ki omogoča dolgotrajne nizkointenzivne aktivnosti pri vzdržljivostnih športih (npr. tek, kolesarjenje), in mišična (fizična) moč, ki je ključna pri visokointenzivnih, eksplozivnih športih (npr. šprint, dvigovanje uteži). Pri nekaterih moštvenih športih, kot je npr. nogomet, pa sta za uspeh športnika pomembna tako moč in hitrost kot tudi vzdržljivost. Nogometno ekipo sestavlja enajst igralcev na različnih osnovnih igralnih položajih z različnimi igralnimi nalogami (vratarji, napadalci, branilci in vezisti). Pri tem določeni igralni položaji zahtevajo več mišične moči in hitrosti, drugi pa več vzdržljivosti (4). Med dejavnike, ki vplivajo na uspešnost v športu, prištevamo tudi dovzetnost za poškodbe, zlasti poškodbe mišic (5, 6).

Eden najbolj raziskanih genov, povezanih z vzdržljivostjo, je gen ACTN3, ki ga imenujejo tudi »gen za hitrost«. Pri človeku vsebuje zapis za protein alfa-aktinin-3 (ACTN3) in se specifično izraža v hitrih mišičnih vlaknih tipa II. Protein ACTN3 ima pomembno vlogo strukturne komponente Z-diska v sarkomerah (7). Pogosta sprememba gena ACTN3 je p.R577X (rs1815739), ki povzroči spremembo kodona za arginin (R) v terminacijski kodon (X). V splošni svetovni populaciji je delež homozigotnih nosilcev 17,5 %, delež heterozigotnih nosilcev 48,7 % in delež oseb brez spremembe 33,8 % (8). Posledica prisotnosti te spremembe pri homozigotnih nosilcih z genotipom XX je odsotnost proteina ACTN3 (9), kar vodi v nižji delež in manjši premer hitrih mišičnih vlaken (10). Tako naj bi imeli športniki z genotipom XX večjo mišično vzdržljivost, medtem ko naj bi imeli športniki z normalnim genotipom RR večjo mišično moč (11). Raziskave obenem kažejo, da ima sprememba p.R577X tudi vpliv na hitrost okrevanja po športni aktivnosti in na tveganje za športne poškodbe (2).

Namen naše raziskave je bil oceniti povezavo spremembe p.R577X v genu ACTN3 s pogostostjo športnih poškodb pri mlajših slovenskih nogometašicah ter tudi igralnim položajem posamezne igralke in selekcijo, ki ji pripada.

MATERIALI IN METODE

V raziskavo smo vključili nogometašice iz različnih slovenskih nogometnih klubov. K sodelovanju smo povabili nogometašice, ki so bile stare več kot 13 let in so aktivno trenirale nogomet vsaj štiri leta. Vsaka udeleženka raziskave, oziroma njen starš ali skrbnik v primeru mladoletnosti, je podala pisno soglasje za vključitev v raziskavo in izpolnila anketo o svojih osebnih podatkih, podatkih o aktivnem treniranju nogometa, igralnem položaju in številu ter tipu športnih poškodb. Raziskava je bila opravljena v skladu z načeli Helsinško-Tokijske deklaracije, protokol raziskave je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (št. 0120-428/2020/6).

Okvirni postopek analize za opredelitev spremembe p.R577X gena ACTN3 je prikazan na Sliki 1a. Zbrani slini (1–2 mL) smo za stabilizacijo dodali reagent DNA/RNA Shield (Zymo Research, ZDA) in jo do izolacije genomske DNA (gDNA) hranili na –80 °C. Za izolacijo smo uporabili reagenčni komplet Quick DNA Miniprep Plus Kit (Zymo Research, ZDA) po navodilih proizvajalca. Koncentracijo in čistost izolirane gDNA smo določili spektrofotometrično z aparatom NanoDrop One (Thermo Scientific, ZDA).

Pomnoževanje 319 bp velikega odseka gena ACTN3 smo izvedli z verižno reakcijo s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR), z uporabo smernega začetnega oligonukleotida 5'-ATAGGGATGGGAGGAAAACC-3' in protismernega začetnega oligonukleotida 5'-ATGTAGGGATTGGTGGAGCA-3'. Reakcijska mešanica za PCR je vsebovala 50‒200 ng gDNA, 0,05 pM vsakega začetnega oligonukleotida in 25 μL reakcijskega pufra Platinum™ HotStart PCR Master Mix (Invitrogen, ZDA) v končnem volumnu 50 µL. Ciklično pomnoževanje s 35 cikli smo izvedli na GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, ZDA) z naslednjimi koraki: denaturacija DNA pri 95 °C, prileganje začetnih oligonukleotidov pri 59 °C in podaljševanje pri 72 °C (vsak po 30 s).

Prisotnost spremembe p.R577X gena ACTN3 smo opredelili z restrikcijsko analizo glede na prisotnost (alel p.R577X) ali odsotnost (alel p.R577R) restrikcijskega mesta encima DdeI (NEB, Velika Britanija). Nastale fragmente, ki so shematsko prikazani na Sliki 1b, smo ločili na 2-odstotnem (m/V) agaroznem gelu v pufru TBE. V primeru nejasnih rezultatov restrikcije (pri 28 od 43 vzorcev) smo nukleotidna zaporedja restrikcijskih fragmentov dodatno preverili s sekvenciranjem po Sangerju. Pri tem smo uporabili sekvenčne reagente BigDye Terminator v3.1 in sekvenator ABI Genetic Analyser 3500 (oba Applied Biosystems, ZDA).

Slika 1:

Slika 1: a) Shema postopka za opredelitev spremembe p.R577X gena ACTN3 (rs1815739) in b) shema restrikcije pomnoženega odseka gena ACTN3 z encimom DdeI, če je sprememba p.R577X prisotna ali odsotna.

Figure 1: a) Schematic presentation of the procedure for determining ACTN3 p.R577X (rs1815739) variant and b) schematic presentation of cleavage of the ACTN3 amplicon with the enzyme DdeI when p.R577X is present/absent.

Statistična analiza je bila opravljena s programom GraphPad Prism verzija 9.1.0 (San Diego, Kalifornija, ZDA). Igralke smo razdelili v dve skupini glede na prisotnost spremembe p.R577X gena ACTN3 in primerjali nosilke vsaj enega polimorfnega alela z nosilkami dveh normalnih alelov. Kategorične spremenljivke smo podali s številom in relativno frekvenco, numerične pa z mediano in razponom. Za primerjavo porazdelitve števila poškodb glede na genotip smo uporabili Mann-Whitneyjev test. Za ugotavljanje povezanosti med kategoričnimi spremenljivkami smo uporabili hi-kvadrat test. Razmerje obetov (OR) in 95-odstotni interval zaupanja (95 % CI) za OR smo izračunali s pomočjo programa MedCalc (dosegljiv na: https://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php), ki temelji na Altmanovi metodi. Pri vseh testih smo upoštevali stopnjo značilnosti α = 0,05.

REZULTATI

V raziskavo smo vključili 43 slovenskih nogometašic, ki so bile stare od 13 do 28 let (mediana = 16) in so trenirale nogomet vsaj štiri leta. V članski ekipi je igralo 19 nogometašic, ostale pa so igrale v selekcijah U-17 (n = 10) in U-15 (n = 14). Frekvenca genotipa RR in genotipa XX je bila pri naši populaciji nogometašic za približno 8 % večja, kot bi pričakovali glede na frekvenco alelov R in X, frekvenca genotipa RX pa je bila za približno 16 % nižja (Tabela 1). Kljub temu je število posameznih genotipov še vedno v Hardy-Weinbergovem ravnotežju (p = 0,278).

Pojav vsaj ene poškodbe v preteklih štirih letih je navedlo 22 (53,7 %) preiskovank, od tega zvine, zlome, poškodbe mišic in ostale poškodbe. Od dveh nogometašic podatkov o poškodbah nismo dobili. Povprečno število poškodb v štiriletnem obdobju v celotni skupini je bilo 1,4 (mediana = 1), v skupini nogometašic, ki so imele poškodbo, pa 2,6 (mediana = 2). Največje število poškodb je bilo 9. Najpogostejše so bile poškodbe mišic. Med nogometašicami s prisotno spremembo p.R577X jih je 60,0 % že utrpelo poškodbo, pri nogometašicah z genotipom RR pa je bilo že poškodovanih 43,4 %. Med posameznimi genotipi ACTN3 ni bilo statistično značilnih razlik v pojavnosti (p = 0,309) ali številu poškodb (p = 0,283). Analiza frekvence alelov v povezavi s poškodbami pa je pokazala, da je alel X povezan z večjo pojavnostjo poškodb v primerjavi z alelom R (p = 0,037) (Tabela 2).

Nadalje smo želeli preveriti, ali je analizirana sprememba v genu ACTN3 povezana z igralnim položajem nogometašic, ki smo jih razvrstili v dve skupini. V prvo skupino smo razvrstili položaje, pri katerih sta najpomembnejši moč in hitrost (bočne branilke, krilne in osrednje napadalke), v drugo pa tiste, pri katerih je v večji meri pomembna vzdržljivost (osrednje branilke in vezne igralke). Vratark in igralk, ki so igrale na več različnih položajih, v analizo nismo vključili. Med genotipom in igralnim položajem nismo ugotovili statistično značilne povezave (p = 0,830). Povezava tudi ni bila značilna pri upoštevanju frekvence posameznega alela (p = 0,866). Podatki so prikazani v Tabeli 3. Statistična analiza tudi ni pokazala povezave med igralnim položajem in pojavnostjo poškodb (p = 0,598).

V Tabeli 4 so prikazane frekvence genotipov in alelov glede na selekcijo, v kateri so nogometašice igrale ob vključitvi v študijo. Najvišji delež genotipa RR smo opazili pri članicah (52,6 %). Pojavnost genotipa XX je bila najnižja v selekciji U-17 (10 %). Frekvence genotipov se med selekcijami niso statistično značilno razlikovale (p = 0,427), prav tako ni bilo razlik v frekvenci alelov (p = 0,836).

RAZPRAVA

ACTN3 je prvi gen, za katerega je bila dokazana povezava med genotipom in športno zmogljivostjo (2). V preteklosti so spremembo p.R577X gena ACTN3 povezovali predvsem z mišično močjo (12) in statusom vrhunskih športnikov pri visokointenzivnih športih (13). Danes pa jo povezujejo tudi z dovzetnostjo za pojav športnih poškodb in sposobnostjo regeneracije po športni aktivnosti (14, 15). Namen raziskave je bil pri slovenskih nogometašicah analizirati pojavnost genotipa spremembe p.R577X gena ACTN3 ter frekvenc posameznih alelov v povezavi s pojavnostjo športnih poškodb, igralnim položajem in selekcijo nogometašice. Gre za prvo raziskavo, ki ugotavlja pomen genetskih dejavnikov pri slovenskih nogometašicah, pri kateri smo ugotovili, da sprememba p.R577X gena ACTN3 vpliva na pojavnost poškodb.

Genetska raznolikost profesionalnih nogometašev je odvisna od populacije, ki ji pripadajo (16, 17). V populaciji afriškega porekla je namreč ne glede na športni status frekvenca genotipa RR (~78 %) višja in genotipa XX (~1 %) značilno nižja (18, 19) v primerjavi z ocenjeno frekvenco pri svetovni populaciji (RR ~40 %, XX ~18 %) (8). Tudi naši rezultati se kar dobro ujemajo z ocenjeno frekvenco genotipov pri svetovni populaciji, zanimivo pa je genotip XX v naši populaciji nogometašic celo malo bolj pogost (~8 %). V raziskavi je bil torej najpogostejši genotip RR, kar je v skladu s še nekaterimi drugimi raziskavami (16, 20, 21). Nekatere izmed njih prav tako niso vključevale samo profesionalnih nogometašev. Pri majhni raziskavi na 27 srbskih nogometašicah, starih od 16 do 18 let, je bil s 57 % prevladujoč genotip RX (21). Tudi v številnih drugih raziskavah, ki so vključevale profesionalne nogometaše, so poročali, da je najpogostejši genotip RX (17, 23, 24). Namreč, nogomet je zelo kompleksen šport, ki poleg vzdržljivostne komponente vključuje tudi ponavljajoče visokointenzivne napore (26). Ker se mišična sestava in s tem zmogljivost med različnimi genotipi razlikuje, je pričakovano, da bi se na to situacijo najbolje prilagodili posamezniki z genotipom RX (25). Ugotovili so, da genotip RX deluje zaščitno pri poškodbi mehkih tkiv, medtem ko so pri posameznikih z genotipom XX poškodbe pogostejše (23). Teoretično lastnosti posameznikov z genotipom XX manj ustrezajo fizičnim zahtevam pri igri nogometa prav zaradi eksplozivnih mišičnih naporov (11, 14, 27).

Čeprav je bilo v naši raziskavi največ poškodb pri nogometašicah z genotipom XX, statistična analiza ni pokazala značilnih povezav med genotipi p.R577X gena ACTN3 in pojavnostjo poškodb, kar bi bila lahko posledica tega, da smo zaradi majhnega števila analizo naredili glede na prisotnost oz. odsotnost spremembe. Kljub temu pa smo dokazali statistično značilno večjo pojavnost poškodb pri nogometašicah z alelom X. V prihodnosti bi bilo zato smiselno nadgraditi raziskavo z analizo večjega števila preiskovank, s katero bi lahko preučevali vpliv vsakega od treh genotipov. Genotip RR je bil najpogostejši pri članicah, prav tako je bil ta genotip pri članicah najbolj zastopan v primerjavi z genotipoma RX in XX. To bi lahko nakazovalo na to, da nogometašice, ki imajo alel X, zaradi pogostejših poškodb prej opustijo treniranje nogometa. Do takšne ugotovitve je prišla tudi raziskava na populaciji brazilskih nogometašev (17). Pokazali so namreč, da je frekvenca genotipa RX pri profesionalnih nogometaših v primerjavi s selekcijo U-14 višja, medtem ko je bil genotip XX manj pogost pri profesionalnih igralcih v primerjavi s selekcijo U-20 oziroma U-15 (17). Sprememba p.R577X gena ACTN3 je bila pri nogometaših povezana tako s pogostostjo kot tudi resnostjo poškodb (15).

Pogostost posameznih alelov ACTN3 se razlikuje med različnimi športi. Alel p.R577R je pogostejši pri posameznikih, ki se ukvarjajo z eksplozivnimi športi (11, 14), medtem ko je pri posameznikih, ki se ukvarjajo z vzdržljivostnimi športi, pogostejši alel p.R577X (11, 14). Metaanaliza 23 raziskav, ki so vključevale tako vzdržljivostne športnike kot tudi športnike, ki se ukvarjajo z eksplozivnimi športi, je pokazala, da je alel p.R577R pogostejši pri slednjih (28). Do enakih zaključkov je prišla tudi metaanaliza raziskav, ki so preučevale le posameznike v eksplozivnih športih (29). Pri nogometu je zaradi različnih igralnih položajev, ki zahtevajo različne sposobnosti igralcev, smiselno pričakovati genetske razlike glede na igralni položaj. Šele pred kratkim je bila izvedena prva taka raziskava, pri kateri so na manjši skupini profesionalnih španskih nogometašev dokazali razliko v porazdelitvi alelov glede na igralni položaj, medtem ko razlika ni bila značilna pri porazdelitvi genotipov (25). V naši raziskavi statistično pomembne povezave nismo dokazali niti pri porazdelitvi genotipov niti porazdelitvi alelov. To je na nek način tudi pričakovano, saj smo v raziskavo vključili tudi nogometašice, ki igrajo v mlajših selekcijah, pri katerih prihaja tudi še do menjav igralnega položaja, da se ugotovi, kje ima igralka največji potencial.

Vloga genetskega testiranja v športu trenutno še nima jasnega mesta, predvsem zaradi etičnih pomislekov in nezadostnega poznavanja dejavnikov, ki vplivajo na športni uspeh (30). Trenutno genetski testi otrok in mladostnikov z namenom iskanja talentov in individualizacijo treninga niso priporočljivi (31, 32). Zaradi dostopnosti komercialnih genetskih testov neposredno naročnikom (angl. Direct to Consumer genetic testing) se ti v praksi pri odraslih pogosto uporabljajo. Dejstvo pa je, da bi bilo prav prepoznavanje nagnjenosti za športne poškodbe v prihodnosti morda smiselno, saj bi omogočilo njihovo aktivnejše preprečevanje. Vsekakor pa bi bilo za zanesljivejšo napoved treba v analizo vključiti večje število genetskih dejavnikov.

Največja omejitev naše raziskave je bila majhno število vključenih nogometašic, zato bodo v prihodnosti potrebne dodatne raziskave za potrditev rezultatov na večji skupini. Poleg tega zaradi mladosti nogometašic sam vpliv spremembe najverjetneje še ni prišel popolnoma do izraza, predvsem glede na igralni položaj. Zanimivo bi bilo ugotoviti tudi delež te spremembe pri profesionalnih igralcih nogometa in njeno povezavo s pojavnostjo poškodb ter igralnim položajem in tudi preučiti morebitne razlike med nogometaši in nogometašicami.

ZAKLJUČEK

Genetska različnost pomembno vpliva na posameznikovo uspešnost pri športu. V zadnjih desetih letih so raziskave, ki preučujejo genetsko raznolikost pri igralcih nogometa, doživele pravi razcvet (2). Vsekakor pa na uspešnost v posameznem športu, vzdržljivost in pogostost poškodb vplivajo tudi negenetski dejavniki, zato je pomembno, da raziskave vključujejo tudi te. Najpogosteje raziskovani gen pri nogometaših v povezavi s športno uspešnostjo je ACTN3 (2). V naši raziskavi smo ugotovili povezavo med porazdelitvijo alelov in pojavnostjo poškodb pri mladih slovenskih nogometašicah, s čimer smo potrdili predhodne ugotovitve, da je sprememba p.R557X povezana z večjo pojavnostjo poškodb. Povezave med igralnim položajem in pojavnostjo spremembe nismo potrdili, kar je nekako pričakovano, saj so nekatere vključene nogometašice šele na začetku kariere. Z intenzivnim raziskovanjem na področju športne genetike lahko v prihodnosti, kljub etičnim pomislekom, pričakujemo porast genetskega testiranja z namenom ugotavljanja predispozicij in sposobnosti posameznika ter seveda nagnjenosti k športnim poškodbam in njihovemu aktivnemu preprečevanju.

FINANCIRANJE

Raziskava je potekala v sklopu raziskovalnega programa P1-0170, ki ga financira Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije.