UVOD
Mitohondriji so ključni organeli evkariontske celice, ki regulirajo energetsko homeostazo, celično signalizacijo, izražanje genov, celični nivo kalcija in celično smrt (1). Posebnost mitohondrijev je, da imajo lasten (mitohondrijski) genom (mtDNA), v katerem je kodiranih 13 mitohondrijskih proteinov, 22 mitohondrijskih tRNA molekul in 2 mitohondrijski ribosomalni RNA molekuli. Velika večina (več kot 1000) mitohondrijskih proteinov pa je zapisanih v jedrni DNA (nDNA) in se po sintezi v endoplazmatskem retikulumu preko kompleksnih transportnih mehanizmov prenašajo v mitohondrij (2). Raznovrstnost mitohondrijskih funkcij igra vlogo tudi pri širokem spektru bolezni, ki so povezane z motnjami v delovanju mitohondrijev. Klinične fenotipe mitohondrijskih bolezni v grobem delimo na nevrološke in ne-nevrološke fenotipe, predstavljajo pa zelo raznovrstne zaplete in motnje – od respiratorne odpovedi, odpovedi jeter, pankreatitisa in sladkorne bolezni ter zaostanka v rasti, pa do optične atrofije, epilepsij in ataksij, miopatije ter periferne nevropatije (2). Analiza genetskega ozadja mitohondrijskih bolezni zajema tako usmerjeno analizo mtDNA, kot tudi analizo nuklearnih genov, ki so povezani s funkcijo mitohondrija. Razvoj tehnologije naslednje generacije sekvenciranja DNA (NGS) je omogočil hkratno analizo tako mtDNA, kot tudi celotnega spektra z mitohondriji povezanih nuklearnih genov, kar je izrazito pospešilo diagnostiko mitohondrijskih bolezni in pomembno skrajšalo čas do samega molekularno-diagnostičnega rezultata (3).
OSNOVNA STRUKTURA IN FUNKCIJA
Mitohondrij je celični organel z dvojno membrano, ki omogoča vzpostavitev protonskega gradienta, ki je ključen pri sintezi molekul ATP. Energijo za vzpostavitev protonskega gradienta med medmembranskim prostorom in mitohondrijskim matriksom zagotavlja proces oksidativne fosforilacije, ki poteka na komponentah dihalne verige, ki se nahajajo na notranji membrani (Slika 1).
V osnovi gre za prenos elektronov iz molekul nikotinamid adenin dinukleotida (NADH), preko proteinskih kompleksov I–IV dihalne verige, na molekule kisika kot končnega prejemnika elektronov. Energija tega procesa omogoča, da proteinski kompleksi I, III in IV delujejo kot protonske črpalke v medmembranski prostor. Tako nakopičeno energijo protonskega gradienta uporabi proteinski kompleks ATP sintaze za fosforilacijo molekule ADP v ATP (4).
DEDOVANJE IN HETEROPLAZMIJA
Velika večina mitohondrijskih proteinov (več kot 1000) je kodirana v jedrni DNA, na mtDNA pa se nahaja zapis za 37 genov; 13 jih zapisuje proteine dihalne verige, 22 jih zapisuje mitohondrijske prenašalne RNA molekule (tRNA), veliko podenoto ribosoma 16s in malo podenoto ribosoma 12s. V posamezni celici se lahko nahaja tudi do 10.000 kopij mtDNA, posamezen mitohondrij lahko vsebuje tudi do 10 kopij mtDNA. Človeško mtDNA sestavlja 16.569 baznih parov, pakiranih v krožno dvoverižno molekulo. Geni, zapisani na mtDNA, ne vsebujejo intronov, kar je dodaten indic, da so se mitohondriji razvili iz simbioze med evkariontsko celico in prokariontom. Več kot 90 % mitohondrijskega genoma predstavlja kodirajoča regija, pomemben element nekodirajoče regije pa je D-zanka, kjer se nahaja iniciacijsko mesto začetka replikacije mtDNA (5, 6, 7). Posebnost mitohondrijev je, da se pri sesalcih dedujejo po materi. Ker je okolje v mitohondriju nasičeno z visoko reaktivnimi spojinami in mtDNA ni zaščitena s histonskimi proteinskimi kompleksi, je delež genetskih sprememb 10- do 20-krat višji kot v jedrni DNA. V celicah posameznika imajo lahko vsi mitohondriji enako mtDNA, kar imenujemo homoplazmija, če pa je del mtDNA mutiran, to stanje imenujemo heteroplazmija. Ugotavljanje stopnje heteroplazmije pri materi je zato pomembno za zagotavljanje ustreznega genetskega svetovanja in napovedovanja verjetnosti prenosa okvarjenih mitohondrijev na plod. Klinično zdrava mati z nizko stopenjsko heteroplazmijo patološke spremembe v mtDNA lahko tako okvarjene mitohondrije prenese na plod, kjer pa se zaradi višjega deleža okvarjenih mitohondrijev (homoplazmija ali višjestopenjska heteroplazmija) razvije mitohondrijska bolezen (8).
BOLEZNI, POVEZANE Z MOTNJO FUNKCIJE MITOHONDRIJA
Vzrok za razvoj mitohondrijske bolezni je lahko genetska okvara nuklearnih genov ali pa prisotnost patološke različice v mtDNA. Pomemben dejavnik pri mitohondrijski motnji, ki izvira iz okvare mtDNA, je tudi morebitna stopnja heteroplazmije oz. homoplazmija patološke različice, ki se odraža v tem, kako hudi in kateri specifični klinični znaki se razvijejo pri posamezniku. Heteroplazmija je lahko sistemska, razširjena po vseh celicah/tkivih organizma, ali pa je patološka različica prevladujoča le v enem organu, specifičnih tkivih, kar zopet vpliva na potek in izraženost mitohondrijske bolezni, prav tako pa lahko pomembno vpliva na uspešnost genetske diagnostike, saj lahko zaradi tkivno specifične heteroplazmije, značilne npr. za progresivno eksterno oftalmoplegijo, ob analizi neustreznega tkiva pride do lažno negativnega rezultata. (1, 2, 5, 6, 9). Minimalna stopnja heteroplazmije okvarjene mtDNA, da se bolezen izrazi, je odvisna od tipa genetske spremembe in posameznega tkiva, ki ga prizadene, okvirno pa se ta meja giblje med 60 in 90 %. Sama stopnja heteroplazmije lahko vpliva tudi na tip izražene mitohondrijske bolezni. Na primer sindrom MELAS se praviloma izrazi že ob nižjih stopnjah heteroplazmije, medtem ko se sindrom Leigh lahko ne izrazi niti ob stopnji heteroplazmije, višji od 60 % (10). V grobem ločimo med mitohondrijskimi boleznimi, ki se izrazijo v otroški dobi, in tistimi, ki se izrazijo v odrasli. Mitohondrijske bolezni, ki se izrazijo že v otroški dobi, imajo običajno težji potek z razmeroma splošnimi in nespecifičnimi kliničnimi znaki, ki segajo od zastoja v razvoju, encefalopatije, hipotonije in drugih (11). Bolj pomembne oz. znane mitohondrijske bolezni, ki nastopijo običajno že v otroški dobi, so sindrom Kearns-Sayre, Pearsonov sindrom ter Leighov sindrom. Pri mitohondrijskih boleznih odrasle dobe pa sindrom mitohondrijske encefalopatije, laktatne acidoze in kapi podobne epizode (MELAS), kronična progresivna eksterna oftalmoplegija (CPEO), nevropatija, ataksija in retinitis pigmentoza (NARP), sindrom mioklonične epilepsije z rdečimi razcefranimi vlakni (MERRF) in Leberjeva hereditarna optična nevropatija (LHON). Ob tem je pomembno poudariti, da se lahko ta sklop mitohondrijskih bolezni izrazi v določenih primerih tudi pri otrocih in najstnikih. Tako se npr. sindrom NARP lahko izrazi že v otroštvu, vendar ne napreduje oz. je lahko stabilen vse do odrasle dobe. Točen potek mitohondrijskih bolezni je izrazito odvisen od okvarjenega gena, obremenitve specifičnega tkiva, stopnje heteroplazmije in tipa patološke genetske spremembe, ki je vzrok za izraženo mitohondrijsko bolezen (11).
TEHNOLOGIJA ANALIZE mtDNA IN Z MITHONDRIJI POVEZANIH NUKLEARNIH GENOV
Razvoj tehnologije sekvenciranja DNA naslednje generacije (NGS) je omogočil masovni preboj v diagnostiki redkih bolezni, ki so izredno raznovrstne in zajemajo več 10.000 genetskih sprememb v več 1000 genih (12, 13, 14). Med redke bolezni spadajo tudi okvare v delovanju mitohondrijev, pri katerih pa je treba razlikovati med analizo mtDNA in genov, povezanih z mitohondrijsko funkcijo, ki se nahajajo v jedrni DNA. Trenutno najbolj ekonomična rešitev je še vedno tarčna obogatitev genomskih regij, ki so diagnostično pomembne. Pri genetiki mitohondrijskih bolezni to pomeni aplikacijo kombinacije specifičnih komplementarnih kratkoverižnih oligonukleotidnih sond, ki se hibridizirajo na specifične regije genoma, ki jih želimo analizirati. Te sonde so funkcionalizirane z molekulami biotina, kar omogoča, da jih po hibridizaciji, skupaj z vezanimi fragmenti DNA preiskovanca, izoliramo z uporabo streptavidinskih paramagnetnih nanodelcev. Tako izoliran (obogaten) nabor fragmentov DNA preiskovanca imenujemo DNA knjižnica, ki jo nato sekvenciramo na NGS sekvenatorju. Po bioinformacijski obdelavi podatkov, med katero sekvencirane fragmente nalegamo na referenčna zaporedja humanega genoma in iz razlik identificiramo prisotne genetske spremembe, lahko preko specifičnih postopkov filtriranja teh genetskih sprememb pridemo do patoloških različic, ki so pomembne za razvoj specifične mitohondrijske bolezni, opredelimo stopnjo heteroplazmije pri preiskovancu in njegovi materi, ter tako omogočimo učinkovito genetsko svetovanje družini in morebitno klinično intervencijo za bolnika (če je le-ta na voljo) (2, 3, 15). S padanjem cen sekvenciranja postaja vse bolj dostopno tudi sekvenciranje celotnega humanega genoma, pri katerem se lahko izognemo uporabi specifičnih hibridizacijskih sond, ki lahko v pripravo vzorca vnašajo določeno stopnjo napak in omejitev, s tem pa tudi postopek priprave DNA knjižnice pomembno skrajšamo (16, 17). V sklopu sekvenciranja celotnega humanega genoma je zajeta tudi celotna mtDNA z visoko kakovostnimi podatki, kar omogoča natančno opredelitev stopnje heteroplazmije, identifikacijo različic v številu kopij in strukturnih preureditev mitohondrijskega genoma. Omenjene tehnologije in lastnosti bodo postale še bolj pomembne v luči razvoja novih kliničnih postopkov in farmakoloških učinkovin za lajšanje ter tudi zdravljenje mitohondrijskih bolezni v prihodnosti (15).
ZAKLJUČEK
Široko področje mitohondrijskih bolezni zajema več tisoč genetskih dejavnikov, ki so razporejeni med nuklearni genom celice in specifični mitohondrijski genom samega organela. Izraženi klinični fenotip je odvisen od več dejavnikov – specifičnega gena, ki je okvarjen, tipa patološke različice, ter v primeru patoloških različic v mitohondrijskem genomu, od deleža mitohondrijskih genomov, ki to patološko različico nosijo (stopnje heteroplazmije). Z razvojem novih tehnologij analize DNA (NGS) je postala genetska diagnostika mitohondrijskih bolezni dostopnejša, prav tako pa se je povečal diagnostični izplen. Zmogljivi in ustrezni diagnostični postopki bodo v prihodnosti postali še pomembnejši zaradi razvoja specifičnih, personaliziranih in tarčnih kliničnih intervencij.
